植物Elisa試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被植物活性氧(ROS)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物活性氧(ROS)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測(cè)定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。
植物Elisa試劑盒需要遵循這幾個(gè)細(xì)節(jié):抗原或抗體能吸附于固相載體外表,并堅(jiān)持其免疫學(xué)活性,抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶銜接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能堅(jiān)持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)參加底物的色彩反響來斷定是否有免疫反響的存在,并且色彩反響的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,可根據(jù)已知濃度的抗原或抗體的色彩反響的深淺制作規(guī)范曲線并依此計(jì)算出不知道樣品中抗體或抗原的濃度。
樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的,所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事,否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。
植物Elisa試劑盒采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度,并且要能涵蓋所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),包括上限和下限。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn),但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí),應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行,以減少高濃度對(duì)低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng),但一般來說,相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對(duì)于有些實(shí)驗(yàn),至少要0.99甚至是0.999。